Evaluación de dos antígenos experimentales (DST-F y P22) para el diagnóstico inmunológico de la tuberculosis en ganado bovino

La tuberculosis (TB) bovina es una micobacteriosis zoonósica producida por miembros del Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB), especialmente M. bovis y M. caprae (Valcheva et al., 2022).

La presencia de esta enfermedad en la cabaña ganadera comporta una serie de repercusiones sanitarias y económicas por lo que diversos países, entre ellos España, han instaurado programas de erradicación de la TB en ganado bovino (MAPA, 2025).

Estos programas se basan eminentemente en una estrategia de diagnóstico y sacrificio, principalmente mediante el empleo de la intradermotuberculinización simple y comparada (IDTBs e IDTBc, respectivamente) y el ensayo de liberación de interferón-gamma (IGRA), combinada con bioseguridad y vigilancia en matadero.

¿PUEDEN LOS ANTÍGENOS DST-F Y P22 MEJORAR EL RENDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DIAGNÓSTICAS ANTEMORTEM DE TB BOVINA?

Para la ejecución de las pruebas diagnósticas de carácter oficial, basadas en la respuesta inmunitaria de base celular, se emplean unos antígenos denominados derivados proteicos purificados (PPDs) o tuberculinas (MAPA, 2025).

Sin embargo, las PPDs tienen una serie de limitaciones:

Presentan variabilidad en su composición proteica, lo que puede influir en la potencia biológica del producto final, existiendo diferencias entre fabricantes e incluso entre lotes debido a las variaciones en su producción descritas en distintos estudios (Dobbelaer et al., 1983; Good & Duignan, 2011; Balks et al., 2025).

El hecho de que algunos antígenos de las PPDs se compartan entre micobacterias del CMTB y micobacterias no tuberculosas, puede dar lugar a la aparición de interferencias diagnósticas en las pruebas oficiales (Fernández-Veiga et al., 2023).

Por estas razones, en los últimos años se han desarrollado diferentes líneas de investigación con el objetivo de identificar, producir y evaluar nuevos antígenos con elevada sensibilidad y especificidad, y cuyo proceso de producción y composición sea más homogéneo y estandarizable que el de las PPDs, especialmente en el caso de péptidos sintéticos o proteínas recombinantes (Middleton et al., 2021; Jones et al., 2022).

Como resultado de estas investigaciones, en los últimos años se han desarrollado:

• Mezclas de antígenos sintéticos, como ESAT-6, CFP-10, y Rv3615c (Jones et al., 2022).
• Inmunocomplejos purificados a partir de la de la PPD bovina (PPDb) como el complejo proteico P22 (Infantes- Lorenzo et al., 2017).

Originalmente, estos nuevos antígenos se destinaron principalmente para su uso en técnicas in vitro (IGRA y serología) (Sidders et al., 2008; Infantes-Lorenzo et al., 2019), siendo en los últimos años cuando se han empezado a realizar estudios para evaluar su rendimiento en técnicas in vivo (Arrieta- Villegas et al., 2020; Jones et al., 2022).

En el caso concreto de las mezclas peptídicas, las investigaciones iniciales iban encaminadas a obtener un producto DIVA (por sus siglas en inglés Differentiating Infected from Vaccinated Animals) que permitiese discernir entre animales vacunados e infectados (Vordermeier et al., 2016).

Sin embargo, en los últimos años las líneas de investigación que conciernen a estos antígenos han evolucionado a escenarios diagnósticos sin vacunación (Kumar et al., 2021).

El objetivo principal era desarrollar alternativas a las PPDs con una mayor especificidad y una sensibilidad similar.

Adicionalmente, en el caso de las mezclas sintéticas, permitiría estandarizar la producción y composición, reduciendo la necesidad de pruebas de potencia biológica en animales para su validación, que son complejas, poco reproducibles y no siempre representativas de la calidad del producto final (Balks et al., 2025; Good et al., 2011).

Uso de DST-F y P22 en IDTB e IGRA

El uso de estos antígenos en la IDTB y en el IGRA en diferentes especies (bóvidos domésticos y caprino) ha mostrado resultados prometedores en términos de sensibilidad y especificidad, de manera que podrían representar una posible alternativa a las PPDs en el futuro (Arrieta-Villegas et al., 2020; Kumar et al., 2021; Middleton et al., 2021; Jones et al., 2022; Subramanian et al., 2022).

  DST-F  

El DST-F ha sido evaluado principalmente en ganado bovino (Jones et al., 2022; Subramanian et al., 2022; Holder et al., 2023) y búfalos (Kumar et al., 2021) en estudios a pequeña escala observándose, en líneas generales, una mayor especificidad que cuando se utiliza la PPDb y una sensibilidad similar, constituyendo por tanto un potencial candidato para sustituirla.

  Complejo P22  

No existían datos relativos al funcionamiento del complejo P22 con respecto a las PPDs para la realización de la IDTB e IGRA en ganado bovino.

En caprino, un estudio a pequeña escala observó un mejor rendimiento de ambas técnicas oficiales empleando P22 como antígeno con respecto a PPDs (Arrieta-Villegas et al., 2020) y ha sido evaluado principalmente en técnicas de detección de anticuerpos (Ortega et al., 2022; Velasco et al., 2024).

EVALUACIÓN DEL RENDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE BASE CELULAR EMPLEANDO EL DST-F Y LA P22 COMO ANTÍGENOS EN PRUEBAS DE CAMPO: EL PROYECTO imdiTBap

El proyecto internacional “Improving the diagnosis of tuberculosis in domestic ruminants through the use of new antigens and test platforms” (imdiTBap)” tiene como uno de sus principales objetivos la evaluación del rendimiento diagnóstico de los antígenos DST-F y P22 en diferentes especies de rumiantes domésticos y condiciones sanitarias y epidemiológicas, encuadrándose los resultados de este artículo dentro del mismo.

Diseño del estudio

Dentro de las actividades comprendidas en este proyecto, el centro VISAVET ha evaluado el rendimiento de las técnicas oficiales de diagnóstico de TB de base inmunológica en ganado bovino empleando DST-F y P22 en comparación con los resultados obtenidos empleando las PPDs.

En el desarrollo de las actividades necesarias para cumplir este objetivo, se evaluó el rendimiento de la IDTB e IGRA en vacas de cuatro explotaciones con TB (confirmadas mediante cultivo bacteriológico) empleando los nuevos antígenos y las PPDs tradicionales.

En el caso de las pruebas intradérmicas, los animales (n=103) fueron sometidos a la IDTBs, IDTBc y una intradermorreacción (IDR) con DST-F (IDR-DST-F) y P22 (IDR-P22).

• Previo a la realización de las pruebas intradérmicas se tomaron muestras de sangre de estos mismos animales para una posterior estimulación con las PPDs tradicionales, DST-F y P22 y realizar la técnica del IGRA con el kit comercial Bovigam (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EEUU).
• Los criterios de interpretación para las diferentes pruebas intradérmicas (IDTBs, IDTBc e IDR) y la técnica de IGRA vienen descritos en las Tablas 1 y 2.

Para establecer las diferencias en lo relativo a la proporción de reactores a las diferentes técnicas utilizando diferentes antígenos en el estudio se analizaron estadísticamente utilizando el test Q de Cochran y de McNemar ajustando el valor p con la corrección de Bonferroni y considerando un valor p de 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados preliminares

El mayor número de reactores a las pruebas intradérmicas (IDTBs-IDR) se detectó al emplear como antígeno la P22, tanto empleando un criterio de interpretación estándar (7/103; 6,8 %) como severo (10/103; 9,7 %), seguida de la PPDb (6/103; 5,8 % y 8/103; 7,8 %; respectivamente) y DST-F (4/103; 3,9 % con ambas interpretaciones).

En el caso del DST-F, el número de reactores se incrementó utilizando un punto de corte extra-severo (recomendado por el fabricante) obteniéndose un número de reactores similar al observado con la interpretación estándar de la IDR-P22 (7/103; 6,8 %) y ligeramente superior a la de la IDTBs (6/103; 5,8 %).

En cambio, el uso de las interpretaciones estándar y severa (4/103; 3,9 %) de la IDR-DST-F condujo a una reactividad de la técnica similar a la IDTBc, especialmente a su interpretación severa (4/103; 3,9 %) (Tabla 1 y Gráfica 1).

Hubo diferencias significativas en la proporción de reactores al emplear los diferentes antígenos (p < 0,05):

El número de reactores a la interpretación severa de la IDR-P22 fue significativamente mayor (p < 0,05) con respecto al observado a la misma interpretación de la IDR-DST-F (Gráfica 1).

Se observó un mayor número de reactores al emplear la P22 como antígeno con respecto a la PPDb, siendo contrario a lo observado en un estudio previo en ganado caprino (Arrieta-Villegas et al., 2020).

En cuanto al DST-F, la menor reactividad mostrada con este antígeno en las pruebas intradérmicas con respecto a la PPDb ha sido observada en estudios previos en ganado bovino infectado (Jones et al., 2022; Holder et al., 2023).

Sin embargo, son necesarios más estudios que permitan confirmar los hallazgos observados en este estudio, especialmente en lo relativo a las diferencias observadas en la reactividad entre P22 y DST-F, al ser el primer estudio en el que se comparan ambos antígenos en esta especie.

Respecto al rendimiento mostrado por el IGRA, los resultados de la reactividad obtenida se describen en la Tabla 2.

Se obtuvieron reactividades muy similares con los tres antígenos (PPDb, DST-F y P22) utilizando el kit Bovigam (Tabla 2 y Gráfica 2).

De hecho, no se observaron diferencias significativas (p > 0,05) en las muestras estimuladas (n=103) con los diferentes antígenos que resultaron positivas, obteniéndose un porcentaje de reactores del 20,4 % (21/103), del 21,4 % (22/103) y del 22,3 % (23/103) empleando PPDb, DST-F y P22, respectivamente.

CONCLUSIONES

En el presente estudio, el mayor rendimiento diagnóstico de las pruebas intradérmicas (IDTB/IDR) se obtuvo al emplear P22 como antígeno, seguido de la PPDb y el DST-F, este último muy similar al observado al aplicar la IDTBc y significativamente menor que el observado con P22.

En cambio, no se observaron diferencias significativas en el rendimiento diagnóstico mostrado por el IGRA utilizando PPDb, DST-F y P22, presentándose variaciones mínimas entre la reactividad mostrada por los diferentes antígenos.

Agradecimientos

Esta investigación ha sido posible gracias a la financiación de ICRAD, una red ERA- NET cofinanciada por el programa de investigación e innovación Horizon 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención nº862605, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades de España (MCIN/AEI/10.13039/501100011033) a través del proyecto “Improving the diagnosis of tuberculosis in domestic ruminants through the use of new antigens and test platforms” (referencia PCI2023-143368), y el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación de España.

BIBLIOGRAFÍA
1. Arrieta-Villegas, C., Infantes-Lorenzo, J. A., Bezos, J., Grasa, M., Vidal, E., Mercader, I., Singh, M., Domingo, M., de Juan, L., & Pérez de Val, B. (2020). Evaluation of P22 Antigenic Complex for the Immuno-Diagnosis of Tuberculosis in BCG Vaccinated and Unvaccinated Goats. Frontiers in veterinary science, 7, 374. https://doi.org/10.3389/fvets.2020.00374

2. Balks, E., Trösemeier, J. H., Mühlebach, M. D., & Reuter, A. (2025). Mass spectrometry analysis of bovine tuberculins – 3R potential in batch potency testing. Biologicals: journal of the International Association of Biological Standardization, 90, 101825. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2025.101825

3. Dobbelaer, R., O’Reilly, L. M., Génicot, A., & Haagsma, J. (1983). The potency of bovine PPD tuberculins in guinea-pigs and in tuberculous cattle. Journal of biological standardization, 11(3), 213–220. https://doi.org/10.1016/s0092-1157(83)80008-0

4. Fernández-Veiga, L., Fuertes, M., Geijo, M. V., Pérez de Val, B., Vidal, E., Michelet, L., Boschiroli, M. L., Gómez-Buendía, A., Bezos, J., Jones, G. J., Vordermeier, M., Juste, R. A., Garrido, J. M., & Sevilla, I. A. (2023). Differences in skin test reactions to official and defined antigens in guinea pigs exposed to non-tuberculous and tuberculous bacteria. Scientific reports, 13(1), 2936. https://doi.org/10.1038/s41598-023-30147-4

5. Good, M., Clegg, T. A., Murphy, F., & More, S. J. (2011). The comparative performance of the single intradermal comparative tuberculin test in Irish cattle, using tuberculin PPD combinations from different manufacturers. Veterinary microbiology, 151(1-2), 77–84. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2011.02.028

6. Good, M., & Duignan, A. (2011). Perspectives on the History of Bovine TB and the Role of Tuberculin in Bovine TB Eradication. Veterinary medicine international, 2011, 410470. https://doi.org/10.4061/2011/410470

7. Holder, T., Coad, M., Allan, G., Hogarth, P. J., Vordermeier, H. M., & Jones, G. J. (2023). Vaccination of calves with Bacillus Calmette-Guerin Danish strain 1331 results in a duration of immunity of at least 52 weeks. Vaccine, 41(48), 7290–7296. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2023.10.060

8. Infantes-Lorenzo, J. A., Moreno, I., Risalde, M. L. Á., Roy, Á., Villar, M., Romero, B., Ibarrola, N., de la Fuente, J., Puentes, E., de Juan, L., Gortázar, C., Bezos, J., Domínguez, L., & Domínguez, M. (2017). Proteomic characterisation of bovine and avian purified protein derivatives and identification of specific antigens for serodiagnosis of bovine tuberculosis. Clinical proteomics, 14, 36. https://doi.org/10.1186/s12014-017-9171-z

9. Infantes-Lorenzo, J. A., Moreno, I., Roy, A., Risalde, M. A., Balseiro, A., de Juan, L., Romero, B., Bezos, J., Puentes, E., Åkerstedt, J., Tessema, G. T., Gortázar, C., Domínguez, L., & Domínguez, M. (2019). Specificity of serological test for detection of tuberculosis in cattle, goats, sheep and pigs under different epidemiological situations. BMC veterinary research, 15(1), 70. https://doi.org/10.1186/s12917-019-1814-z

10. Jones, G. J., Konold, T., Hurley, S., Holder, T., Steinbach, S., Coad, M., Neil Wedlock, D., Buddle, B. M., Singh, M., & Martin Vordermeier, H. (2022). Test performance data demonstrates utility of a cattle DIVA skin test reagent (DST-F) compatible with BCG vaccination. Scientific reports, 12(1), 12052. https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

11. Köhler, H., Liebler-Tenorio, E., Hughes, V., Stevenson, K., Bakker, D., Willemsen, P., Bay, S., Ganneau, C., Biet, F., & Vordermeier, H. M. (2021). Interferon-γ Response of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Infected Goats to Recombinant and Synthetic Mycobacterial Antigens. Frontiers in Veterinary Science, 8, 645251. https://doi.org/10.3389/fvets.2021.645251 

12. Kumar, T., Singh, M., Jangir, B. L., Arora, D., Srinivasan, S., Bidhan, D., Yadav, D. C., Veerasami, M., Bakker, D., Kapur, V., & Jindal, N. (2021). A Defined Antigen Skin Test for Diagnosis of Bovine Tuberculosis in Domestic Water Buffaloes (Bubalus bubalis). Frontiers in veterinary science, 8, 669898. https://doi.org/10.3389/fvets.2021.669898

13. MAPA. Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación. Programa Nacional de Erradicación de Tuberculosis Bovina 2025 (Infección por el complejo Mycobacterium tuberculosis). (2025). Available online at: https://www.mapa.gob.es/es/ganaderia/temas/sanidad-animal-higiene-ganadera/programatb2025_18022025_tcm30-698268.pdf

14. Middleton, S., Steinbach, S., Coad, M., McGill, K., Brady, C., Duignan, A., Wiseman, J., Gormley, E., Jones, G. J., & Vordermeier, H. M. (2021). A molecularly defined skin test reagent for the diagnosis of bovine tuberculosis compatible with vaccination against Johne’s Disease. Scientific reports, 11(1), 2929. https://doi.org/10.1038/s41598-021-82434-7

15. Ortega, J., Infantes-Lorenzo, J. A., Roy, Á., de Juan, L., Romero, B., Moreno, I., Domínguez, M., Domínguez, L. & Bezos, J. (2022). Factors affecting the performance of P22 ELISA for the diagnosis of caprine tuberculosis in milk samples. Research in Veterinary Science, 145, 40–45. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2022.02.008

16. Sidders, B., Pirson, C., Hogarth, P. J., Hewinson, R. G., Stoker, N. G., Vordermeier, H. M., & Ewer, K. (2008). Screening of highly expressed mycobacterial genes identifies Rv3615c as a useful differential diagnostic antigen for the Mycobacterium tuberculosis complex. Infection and immunity, 76(9), 3932–3939. https://doi.org/10.1128/IAI.00150-08

17. Subramanian, S., Srinivasan, S., Ramaiyan Selvaraju, K., Vinoli, P. M., Selladurai, S., Ramasamy, B., Kumaragurubaran, K., Bakker, D., Vordermeier, M., Kapur, V., & Gopal, D. R. (2022). Defined Antigen Skin Test for Bovine Tuberculosis Retains Specificity on Revaccination With Bacillus Calmette-Guerin. Frontiers in Veterinary Science, 9, 814227. https://doi.org/10.3389/fvets.2022.814227

18. Valcheva, V., Perea, C., Savova-Lalkovska, T., Dimitrova, A., Radulski, L., Mokrousov, I., Marinov, K., Najdenski, H., & Bonovska, M. (2022). Mycobacterium bovis and M. caprae in Bulgaria: insight into transmission and phylogeography gained through whole-genome sequencing. BMC Veterinary Research, 18(1), 148. https://doi.org/10.1186/s12917-022-03249-w

19. Velasco, C., Ortega, J., Ricón, J., Romero, B., de Juan, L., Domínguez, L., Domínguez, M., Moreno, I., Álvarez, J., & Bezos, J. (2024). Effect of a recent intradermal test on the specificity of P22 ELISA for the diagnosis of caprine tuberculosis. Frontiers in veterinary science, 11, 1358413. https://doi.org/10.3389/fvets.2024.1358413

20. Vordermeier, H. M., Jones, G. J., Buddle, B. M., & Hewinson, R. G. (2016). Development of immune-diagnostic reagents to diagnose bovine tuberculosis in cattle. Veterinary immunology and immunopathology, 181, 10–14. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2016.02.003