Científicos de la Universidad de Saskatchewan (USask) han descubierto cómo un gen previamente pasado por alto, está involucrado en la resistencia a los antimicrobianos
- En este estudio se presenta la identificación y caracterización preliminar de una α/β-hidrolasa que inactiva los macrólidos.
Sigue siendo esencial descubrir genes de resistencia a los antimicrobianos (ARG) que no hayan sido notificados.
El estudio presenta la identificación y caracterización preliminar de una α/β-hidrolasa que inactiva los macrólidos. Esta macrólido esterasa dependiente de serina coexiste con ARG emergentes en el medio ambiente, microbiomas animales y patógenos.
 Esta macrólido esterasa dependiente de serina coexiste con ARG emergentes en el medio ambiente, los microbiomas animales y los patógenos. |
La acumulación de genes de resistencia a los antimicrobianos (ARG) en entornos específicos y, con el tiempo, en patógenos, pone en entredicho la utilidad de los antibióticos. Se conocen miles de ARG y de mutaciones que confieren resistencia, a los que se puede acceder en bases de datos curadas.
Sin embargo, nuestro catálogo de ARG está incompleto. Los puntos ciegos -los ARG nuevos y no comunicados suponen riesgos desconocidos para la salud humana, el bienestar animal y la sostenibilidad de la agricultura.
Un ARG nuevo y no comunicado es aquel que no puede identificarse mediante inferencia basada en homología. Estos genes desconocidos están ausentes de las bases de datos de ARG que sirven a los programas de vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos (AMR) destinados a informar la práctica clínica. La creciente preocupación por el uso y la eficacia de los antimicrobianos llevó a evaluar los bebederos como sistemas centinela para la detección de ARG en un cebadero de ganado vacuno.
La identificación y caracterización funcional de un ARG desatendido resultante constituyen la base de este informe.
El cultivo selectivo de bacterias multirresistentes procedentes de bebederos de un cebadero del oeste de Canadá dio lugar al aislamiento de Sphingobacterium faecium WB1.
El genoma de S. faecium WB1 incluye un plásmido de 17,5 kb con un grupo de tres ARG y una α/β-hidrolasa no anotada. Una búsqueda de homólogos mostró que este gen huérfano se encuentra en microbiomas animales y genomas de patógenos.
Un análisis retrospectivo de proyectos de secuenciación relevantes confirmó la alta prevalencia de la α/β-hidrolasa en dos agentes causantes conocidos de la enfermedad respiratoria bovina (ERB) y bacterias que infectan aves de corral y cerdos. Además, esta α/β-hidrolasa coexiste con tet(X4), un gen emergente de resistencia a la tigeciclina.
La localización física de la α/β-hidrolasa cerca de ARGs, transposasas y/o en plásmidos explica su distribución cosmopolita y su presencia incluso en el microbioma humano.
Es importante destacar que la concordancia entre los ARGs encontrados en un organismo recuperado de los bebederos y los patógenos relevantes pone de relieve el pragmatismo de este enfoque.
| Las α/β-hidrolasas catalizan diversas reacciones utilizando una tríada catalítica. La enzima de S. faecium tiene una tríada Ser-His-Asp pero una baja identidad de secuencia con enzimas bien estudiadas. La hidrólisis del enlace C-O es la actividad α/β-hidrolasa más frecuentemente descrita, aunque más de un tercio de los miembros de la superfamilia no están anotados funcionalmente.
Para evaluar el hipotético papel de la α/β-hidrolasa en la RAM, el gen y la secuencia de 194 pb aguas arriba, transformaron en Escherichia coli DH5α utilizando un plásmido de alto número de copias. El cribado fenotípico de Escherichia coli transformada con la α/β-hidrolasa mostró un aumento ≥32- o ≥4 veces en la concentración inhibitoria mínima (CIM) de tildipirosina o tilmicosina en comparación con los transformantes portadores de una variante S126A catalíticamente inactiva.
A continuación, se purificaron la α/β-hidrolasa, que denominamos EstT, y la variante S126A para un ensayo bioquímico. Produjeron dos formas por Escherichia coli, y se caracterizó la forma de menor peso molecular (EstT25-306). Se probaron seis macrólidos -eritromicina, tulatromicina, gamitromicina, tilosina, tilmicosina y tildipirosina- como sustratos en función de las variaciones en el tamaño de sus macrociclos de 14 a 16 átomos. Los productos de las reacciones catalizadas por EstT y EstT S126A se analizaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) acoplada con ultravioleta (UV) y espectrometría de masasa. Los macrólidos con anillos de 16 miembros tilosina, tilmicosina y tildipirosina fueron sustratos de EstT.
Estos macrólidos se convirtieron rápida y completamente en productos que mostraron desplazamientos de masa de 18 amu, consistentes con la hidrólisis de la lactona macrocíclica. Por el contrario, los macrólidos de 14 y 15 átomos no fueron hidrolizados por EstT. En experimentos de control, no se observó hidrólisis de tilmicosina utilizando proteínas citosólicas de Escherichia coli enriquecidas adventiciamente por IMAC, y el producto hidrolítico parecía ser relativamente estable.
La hidrólisis limitada observada en las reacciones S126A:macrólido puede deberse a que el agua actúa como nucleófilo en el sitio activo de la variante, lo que exige una mayor investigación del mecanismo catalítico. Debe completarse la caracterización robusta de EstT y homólogos para definir mejor las especificidades de sustrato de estas enzimas.
El descubrimiento de una nueva macrólido esterasa es notable. Es un ejemplo de evolución convergente para explotar la hidrólisis de lactona para la inactivación de macrólidos. Las eritromicina esterasas (EreA-D) son las únicas otras macrólido esterasas conocidas y, a diferencia de la EstT, hidrolizan eficazmente macrolactonas de 14 y 15 átomos utilizando una díada Glu-His formada por un pliegue estructural proteico distinto.
En el contexto de la búsqueda centrada en la agricultura, la presencia de estT concilia la discordancia notificada anteriormente entre los genotipos de RAM y los fenotipos del patógeno respiratorio bovino M. haemolytica.
| Increíblemente, estT se ha pasado por alto a pesar de los informes preeminentes sobre su presencia en loci emergentes de resistencia a la tigeciclina. |
Además, en la década de 1980 se halló otra α/β-hidrolasa de función desconocida denominada EstX junto a una ARG conocida en bacterias aisladas de cerdos, aguas residuales y personas. EstX y EstT comparten un 44% de identidad, haciendo de nuestra caracterización de EstT un caso de estudio de cómo genes mal anotados pueden pasar desapercibidos o no estudiados durante décadas a pesar de un patrón de proximidad a ARGs conocidos y fácilmente identificados. |
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En última instancia, los resultados hablan de la necesidad de análisis sistemáticos para identificar nuevos ARGs basados en cómo se diseminan colectivamente.
Referencias:
Dhindwal, P., Thompson, C., Kos, D., Planedin, K., Jain, R., Jelinski, M., & Ruzzini, A. (2023). A neglected and emerging antimicrobial resistance gene encodes for a serine-dependent macrolide esterase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 120(8), e2219827120. https://doi.org/10.1073/pnas.2219827120
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